近年来，细胞和基因治疗（Cell & Gene Therapy, CGT）领域取得了显著突破。以抗CD19和BCMA为代表的多种CAR-T免疫细胞疗法在攻克血液肿瘤方面获得成功，而基于AAV载体的基因疗法则为罕见病提供了新的治疗方案。

同时，CRISPR基因编辑技术的发展更是开启了基因治疗的新纪元，体外基因编辑疗法CTX001即将上市，体内基因编辑疗法也展现了优良的临床数据。然而，CRISPR技术的安全性引发了广泛关注。由于其直接作用于基因组DNA，任何不准确的更改都可能带来长期风险。因此，FDA等监管机构提出了关于基因治疗安全性的指导原则，主要集中在两个方面：一是评估基因组完整性，包括染色体重排、大片段插入或缺失、外源DNA整合及其潜在致癌性；二是识别脱靶编辑活动的类型、频率和位置。

为确保基因编辑的安全性和有效性，各类脱靶检测技术应运而生。脱靶效应（Off-target effect）是指在基因编辑过程中，CRISPR-Cas9等工具除了对目标序列进行编辑外，还可能错误作用于其他与目标序列相似的非目标位点，导致意外的基因组改变。以下是几种主流的脱靶检测技术。

体内检测方法

体内检测方法在活细胞或生物体内进行脱靶效应评估，通常更接近真实的生物环境。

GUIDE-seq

GUIDE-seq（Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing）是一种用于检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的强大工具。它通过向细胞引入双链寡核苷酸标记物（dsODN），这一标记物可以插入到由Cas9产生的DNA双链断裂（DSBs）位点中，并利用高通量测序技术识别这些被标记的位点，从而全面发现潜在的脱靶编辑位置。

优点：提供全基因组水平上的脱靶位点信息，直接检测体内真实的双链断裂事件；能检测低频的脱靶事件。

缺点：实验操作相对复杂，技术要求高；可能会错过那些不易被标记物插入的脱靶位点。

应用场景：基因治疗安全性评估，CRISPR工具优化，基础研究等。

DISCOVER-Seq

DISCOVER-Seq（Disruption of Cas9 binding sites followed by sequencing）是一种创新性的方法，用于检测CRISPR-Cas9基因编辑过程中的脱靶效应。它通过监测Cas9蛋白与DNA结合位点的变化来揭示潜在的脱靶位点，为研究者提供了更精确的解决方案。

优点：在活细胞中实时监控Cas9-DNA相互作用，提供非侵入式检测，减少对细胞正常生理状态的影响。

缺点：实验设计复杂，需要特定设备及技术支持；数据分析需要专业知识。

应用场景：广泛涵盖基础研究至临床前试验，确保CRISPR工具的安全性和有效性。

体外检测方法

体外检测方法在实验室条件下进行，使用从生物体提取的成分或合成的材料，可以提供对特定因素的精确控制。

Digenome-seq

Digenome-seq是一种用于全面检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的高通量测序方法。其通过在体外使用纯化的基因组DNA模拟Cas9核酸酶切割作用，进而识别由Cas9造成的双链断裂位点。

优点：能在全基因组水平上无偏见地鉴定脱靶位点，提供比预测更高的准确性。

缺点：可能会遗漏仅在细胞内环境中发生的脱靶事件；需要大量起始DNA及复杂的分析流程。

应用场景：验证新设计sgRNA的特异性与安全性评估。

金年会金字招牌诚信至上

在基因编辑技术的快速发展中，安全性和有效性仍是关键问题。面对脱靶风险的管理，组合多种检测方法是全面评估的必要方式。未来，我们期待更多高效、可靠的脱靶检测手段能够出现，进一步提升基因编辑技术的可控性和安全性。

舒桐科技在过去的两年中，已经成功建立了一站式基因编辑安全性评估平台，包括靶点设计、靶点筛选、GUIDE-seq脱靶检测、AID-seq脱靶检测等多个管线。我们的实验室具备SGS认证、ISO9001质量体系认证及生物安全二级实验室等认证，为客户提供优质、高效、安全的服务。

此外，在对海量基因组的挖掘与分析中，舒桐科技也开发了一种具备高切割效率和低脱靶效应的新型CRISPR-FrCas9，其效率优于常规的SpCas9，显著提升了基因编辑的准确性。这一成果在国际顶尖期刊《Nature Communications》上发表，并已获得多国专利。